1.1

摘要

核酸是由許多核酸聚合而成的生物大分子化合物，是生命最基本的物質(zhì)之一。核酸廣泛存在于所有動物、植物細胞、微生物和生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。核酸、化學(xué)的組成不同，核酸序列也不同。根據(jù)化學(xué)、核酸的組成可分為核糖核酸，簡稱RNA和脫氧核糖核酸，簡稱DNA。

DNA是儲存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，RNA在蛋白質(zhì)的合成中起著重要作用，其中轉(zhuǎn)運核糖核酸，簡稱tRNA，起著攜帶和轉(zhuǎn)運活性氨基酸的作用:mRNA是合成蛋白質(zhì)的模板；核糖體核酸，簡稱rRNA，是細胞合成蛋白質(zhì)的主要場所。

1.2

核酸提取樣本

常見樣本:血液、動植物組織、細菌、細胞、病毒、骨髓、體液等。

疑難樣本:唾液、痰液、土壤、糞便、毛發(fā)、石蠟包埋組織、骨骼、牙齒、指甲、煙頭等。

1.3

核酸提取方法

核酸兩個分子，包括DNA和RNA，在細胞內(nèi)與蛋白質(zhì)結(jié)合。核酸提取的主要步驟是:裂解細胞去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)和生物大分子如多糖和脂質(zhì)，以及其他不需要的核酸分子，如提取。沉淀核酸純化核酸去除鹽和有機試劑等雜質(zhì)。

1.3.1堿裂解法

堿裂解法是基于DNA變性和復(fù)性的差異來達到分離的目的。

1.3.2.煮沸法

煮沸時，樣品中的DNA在核酸裂解物的作用下釋放出來。離心沉淀后去除雜質(zhì)，上清液可用于PCR擴增。

1.3.3濃鹽法

RNA和DNA在電解質(zhì)溶液中的溶解度不同而被分離。常用的方法是用1M氯化鈉提取它們。用含有少量辛醇的氯仿?lián)u動獲得的DNP粘液，乳化，然后離心除去蛋白質(zhì)。此時，蛋白質(zhì)凝膠停留在水相和氯仿相的中間，而DNA處于上層水相，用2倍體積的95%乙醇可提取/kloc。

1.3.4苯酚提取法

作為一種蛋白質(zhì)變性劑，苯酚也抑制脫氧核糖核酸酶的降解。當(dāng)勻漿用苯酚處理時，由于蛋白質(zhì)與DNA之間的鍵已經(jīng)斷裂，蛋白質(zhì)分子表面含有許多類似苯酚的極性基團。蛋白質(zhì)分子溶于酚相，而DNA溶于水相。分離后，取出水層，重復(fù)操作多次，然后將含有DNA的水相合并，利用核酸不溶于乙醇的性質(zhì)，將DNA用乙醇沉淀。此時DNA是一種非常粘稠的物質(zhì)，可以用玻璃慢慢繞成一團取出。該方法的特點是將提取的DNA保持在自然狀態(tài)。

1.3.5水浸提法

根據(jù)核酸的水溶性，組織細胞破碎后，用低鹽溶液去除RNA，然后將沉淀物溶于水，使DNA完全溶于水。離心后，收集上清液，向上清液中加入固體氯化鈉以調(diào)節(jié)至2。6M。加入兩次95%的酒精，攪拌下立即攪拌出來，然后分別加入66%和80%的酒精。后風(fēng)干得到DNA sample。這種方法提取的DNA蛋白質(zhì)含量較高，一般不使用。為了去除蛋白質(zhì)，可以對這種方法進行改進，在提取過程中加入SDS。

1.3.6陰離子洗滌劑法

蛋白質(zhì)可用SDS或二甲苯鈉等去污劑變性，DNA可直接從生物材料中提取。由于DNA與蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)常以靜電引力或配位鍵結(jié)合，又由于陰離子去污劑能破壞這種價鍵，DNA常被陰離子去污劑提取。

1.3.7硅膠薄膜法

可用于手動提取或自動提取。

硅膠法核酸萃取

1.3.8磁珠法

生物磁珠是一種新型的功能性固體載體，通常用于自動提取，其表面包覆有活性基團，可與多種生物活性物質(zhì)偶聯(lián)。它們還具有液體流動性和固體磁性材料的特性。它們可以在外部磁場的作用下定向移動和定居。去掉外磁場后，稍加振蕩或抽吸，它們就能均勻地分散在液體中，從而使固液相的分離變得非常迅速和方便。通過簡單的洗脫，可以獲得高純度的靶向。

1.5

提取核酸的目的

高完整性和高純度的核酸分子的提取是下游分子生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)。所以高質(zhì)量的核酸提取是必不可少的，他可以做很多很多的分子生物學(xué)實驗。這里簡單介紹一下常見的分子生物學(xué)實驗。

1.5.1個PCR

聚合酶鏈式反應(yīng)(簡稱PCR)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，通過擴增的方法擴增出特定的DNA片段。可以看作是一種特殊的DNA體外復(fù)制。PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))的原理是DNA在體外95℃的高溫下會變成單鏈，低溫下(一般60℃左右)引物和單鏈會根據(jù)堿基的互補配對結(jié)合，然后將溫度調(diào)整到DNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度(72℃左右)，DNA聚合?；诰酆厦傅腜CR儀其實就是一個溫控裝置，可以很好的控制變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度。

1.5.2轉(zhuǎn)基因

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將基因片段轉(zhuǎn)入特定生物體內(nèi)，最終獲得具有特定遺傳性狀的個體的技術(shù)。無論轉(zhuǎn)移的基因來自進化樹上更遠的物種，接受者都可以讀取它。這是因為DNA是一個通用代碼，細胞知道如何讀取它。即使是最密切相關(guān)的物種，如人類和細菌，也有許多相同的基因，這些基因在數(shù)十億年中保持不變?；驈哪睦飦聿皇顷P(guān)鍵，發(fā)揮的功能就是它們的功能，所以轉(zhuǎn)入動物基因的植物不會有動物的味道。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)來自于進化衍生的分子生物學(xué)。基因片段的來源可以是提取特定生物基因組所需的目的基因，也可以是人工合成的具有特定序列的基因片段。將基因片段轉(zhuǎn)入特定生物體內(nèi)，與其自身基因組重組，然后從重組體中人工繁殖世代，從而獲得具有特定遺傳性狀的個體。這項技術(shù)可以增加重組生物的預(yù)期新性狀，培育新品種。

1.5 .3基因文庫的構(gòu)建

用限制性酶部分消化生物體的基因組DNA并將限制性片段插入載體DNA分子中。插入了基因組DNA片段的所有這些載體分子的集合將包含該生物體的整個基因組，即構(gòu)成該生物體的基因文庫。將這些載體引入受體細菌或細胞，使得每個細胞包含基因組DNA片段和載體重組DNA分子。經(jīng)過繁殖和擴增后，許多細胞一起包含了生物體的全部基因組序列。我們稱這種集合體為基因庫。

將某一生物細胞的total DNA或染色體DNA的所有片段通過重組DNA技術(shù)隨機連接到基因載體上，然后轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞，通過細胞增殖形成每個片段的克隆系統(tǒng)(克隆)。當(dāng)制備的克隆的數(shù)量足夠大以包括某一生物體的所有基因時，整組克隆將是相同的定義也適用于線粒體DNA或葉綠體DNA生物體的基因文庫。因為DNA片段的截斷點是隨機的，所以每個克隆中包含的DNA片段可能是一個或幾個基因，也可能是一個基因的一部分，或者除了完整基因之外還包含兩側(cè)相鄰的DNA序列。

1.5.4分子測序

用DNA聚合酶合成與模板互補的DNA鏈，在三維空間記錄模板位置和核苷酸序列信息，然后反向構(gòu)建模板的序列。除了DNA合成反應(yīng)的三要素(模板、酶、核苷酸)外，模板的位置和單色熒光標(biāo)記的核苷酸序列在反應(yīng)循環(huán)中的位置(如何A、C、G、T)也是最終DNA序列要完成的關(guān)鍵要素。如果用四種不同的熒光標(biāo)記反應(yīng)中使用的核苷酸，那么在每個反應(yīng)循環(huán)中就需要切換不同波長的光來記錄不同的堿基。

1.5.5分子診斷

分子診斷:利用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達水平的變化來做出診斷的技術(shù)，稱為分子診斷。分子診斷是預(yù)測性診斷的主要方法，既可用于個體遺傳病，也可用于產(chǎn)前診斷。分子診斷材料包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)。

分子診斷主要是指檢測編碼與疾病相關(guān)的各種結(jié)構(gòu)蛋白、酶、抗原、抗體和免疫活性分子的基因。

1.5.6親子鑒定

親子鑒定是運用法醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)的理論和技術(shù)，從子代和父母的形態(tài)結(jié)構(gòu)或生理功能上分析遺傳特征，判斷父母和子女是否親生。親子鑒定是司法物證鑒定的主要組成部分。親子鑒定在中國古代就有了，比如骨滴、血滴。

DNA親子鑒定的操作步驟如下:

步驟1: DNA提取

將樣品細胞核中含有的DNA提取出來，然后純化除去樣品中的雜質(zhì)。

二步:PCR擴增

PCR的中文名字叫聚合酶鏈式反應(yīng)。簡單來說，華科基因PCR擴增的步驟就是通過酶促反應(yīng)，在PCR儀上大量復(fù)制出我們需要的片段，擴增到可以通過一些特殊的儀器看到的程度。

步驟3:后PCR反應(yīng)

這一步主要是在ABI測序儀檢測的準備階段。雙鏈DNA是開放的，增加了一些檢測的內(nèi)標(biāo)，主要是標(biāo)記檢測到的片段長度。

步驟4:用毛細管測序儀檢測。

因為DNA是帶電荷的，毛細管電泳不同片段DNA長度的電泳速度不同。在同樣的電壓下，同樣的電泳時間，游泳距離是不一樣的。這些不同的距離可以通過前期加入的內(nèi)標(biāo)測量來區(qū)分，并通過一定的軟件顯示在電腦上，方便檢測人員對數(shù)據(jù)進行處理和分析。

第五步:分析數(shù)據(jù)，出具報告。

主要檢測人員會對得到的結(jié)果進行分析、匯總、計算，然后拿出鑒定結(jié)論和報告。

1.5.7法醫(yī)鑒定

司法鑒定是司法程序中技術(shù)工作的重要組成部分。是運用醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、人類學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)等知識對活體、尸體以及與人有關(guān)的生物證據(jù)的檢驗和鑒定。，從而獲得死因、損傷程度、兇器類型、血型分析、事實確認等結(jié)論性意見。司法鑒定結(jié)論是三大訴訟法中的重要證據(jù)類型。由于與人身關(guān)系密切，司法鑒定結(jié)論在訴訟和非訴訟活動中具有重要意義。它是查明案件事實、區(qū)分案件性質(zhì)的重要依據(jù)。同時也是鑒定案件其他證據(jù)是否真實的重要手段?？梢哉f，司法鑒定的質(zhì)量在一定程度上影響著司法公正。

1.5.8基因敲除

敲除(Knockout)是指一種基因工程技術(shù)，針對功能已知但未知的序列，改變生物體的遺傳基因，使特定基因的功能失去作用，從而使部分功能被阻斷，可以進一步影響生物體，進而推斷該基因的生物學(xué)功能。

基因敲除和基因嵌入是上世紀90年代出現(xiàn)的新外源DNA導(dǎo)入技術(shù)。基因敲除是一種基因打靶技術(shù)，類似于基因的同源重組。是指外源DNA基因與受體細胞基因組中相同或相似序列的同源重組，從而替換受體細胞基因組中相同/相似的基因序列，并整合到受體細胞基因組中。這種方法可以產(chǎn)生準確的基因突變，糾正生物體的基因突變?；蚯度胗址Q基因置換，是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外側(cè)的斷點，將內(nèi)源基因完全替換為同源序列的目的基因。目前用于基因敲除和基因嵌入的有Cre/Lox P系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等。

1.5.9基因芯片

基因芯片(genechip，又稱DNA chip，生物芯片)的雛形于20世紀80年代中期提出。基因芯片的測序原理是雜交測序法，即與一組已知序列的核酸探針雜交確定核酸序列，將8個已知序列的核苷酸探針固定在一個基片表面。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG與基因芯片上相應(yīng)位置的核酸探針互補匹配時，通過確定熒光強度強的探針的位置，可以得到一組序列完全互補的探針序列。所以target 核酸的序列可以重組。

1.5.10 .動植物資源的保存和鑒定

建立瀕危野生動植物遺傳資源庫，實施瀕危野生動植物遺傳保護工程，對于我國瀕危野生動植物的保護和繁衍，對于維護我們賴以生存的環(huán)境生物多樣性和生態(tài)鏈平衡，無疑具有重要意義。然而，對于已經(jīng)進入生物經(jīng)濟時代的人類來說，其意義遠不止于此。

提取高質(zhì)量的核酸在其他領(lǐng)域和方向有重要作用。但是僅僅依靠傳統(tǒng)的核酸萃取方式，很難滿足日益增長的中文核酸萃取市場，所以全自動核酸自動萃取器的出現(xiàn)將為中文核酸萃取市場帶來一抹亮色。